رتبها

مساعد السلطان

11 تغريدة 68 قراءة Jan 27, 2022

شرح لتقنية الـ Western Blot من المختبر مع شرح تفاصيل كاملة لطريقة عملها بمقاطع مترجمة. سيكون التطبيق على kit من شركة Bio-Rad

بداية ما المقصود Western Blotting ؟
هي تقنية يتم فيها عزل البروتينات، لقياس حجم وكمية هذا البروتين.
ما الفائدة من ذلك؟
للكشف عن بعض الامراض الفايروسية والبكتيرية وذلك بتحديد البروتين المرتبط بـ Antigene او المستضد الذي تفرزه الكائنات الدقيقة، او مسببات الامراض الاخرى.

مايحدث كالتالي:
فايروس يفرز—> مستضد Antigene —-> بروتين مرتبط بالمستضد، هنا يتم الكشف على الفايروس. لذلك يتم استخدام الاجسام المضادة في هذه التقنية. ايضا يتم استخدام Western Blot كثيرًا في الفحوصات التأكيدية.
هنا الخطوات الرئيسية للعمل على هذه التقنية

في هذا المقطع يتم التجهيز من ادوات ومحاليل، ثم يتم ملئ طبق بمحلول blotting buffer لمعاييرة الجل قبل البدء في خطوات التقنية، حيث يتم وضع الجل مع المحلول على جهاز هزاز لمدة ١٥ دقيقة.

في هذا المقطع يتم عمل قطعة blotting وذلك بوضعها في محلول blotting، ويكون هناك حامل يمسك هذه القطعة ثم يتم وضعها بعمق ١سم تقريبا، ثم يتم وضع وسادة الياف مع ورق blotting مع الحرص على عدم وجود فقاعات.

هنا سيتم وضع القطع على شكل ساندويش في حامل الجل من ثم يتم وضعها في جهاز الترحيل الكهربائي مع قطعة التبريد المجمدة، بعدها يتم تعبئتها بمحلول blotting

بعد التركيب يتم ضبط التيار الكهربائي على ٢٠ فولت لمدة ساعتين ونصف، بعد الانتهاء يتم ازالة الطبقات حتى الوصول الى غشاء النيتروسليلوز، وسيلاحظ ان البروتينات انتقلت من الجل الى الغشاء.

يتم الان وضع ٢٥ مل من محلول blocking على منصة هزازة لمدة ١٥ دقيقة ثم يتم التخلص منه، بعدها يتم سكب ١٠ مل من محلول الاجسام المضادة الاولي، ويتم تحضّينه لمدة تترواح من ١٠ الى ٢٠ دقيقة.

هنا يتم التخلص من محلول الاجسام المضادة الاولي، بعدها يتم اضافة محلول الغسيل مرتين، الاولى يتم التخلص منه بسرعة والثانية بعد ثلاث دقائق، يتم تكرار الخطوات مع محلول الاجسام المضادة الثانوي.

يضاف الان ١٠ مل من محلول مادة substrate ويحضّن لمدة تترواح من ١٠ الى٣٠ دقيقة، ستلاحظ تغير الالوان، عند ذلك اشطفه بالماء المقطر مرتين وضع عليه غطاء بلاسيتيكي للتخزين.