طريقة سنجر (Sanger procedure ) لتضاعف المادة الوراثية:
هي 1. تعرف بالتسلسل عن طريق دي ديوكسي Dideoxy sequencing .
2. الهدف منها :معرفة تسلسل الحمض النووي وترتيب النيوكليوتيدات ومواقعها في الجين المراد دراستة
هي 1. تعرف بالتسلسل عن طريق دي ديوكسي Dideoxy sequencing .
2. الهدف منها :معرفة تسلسل الحمض النووي وترتيب النيوكليوتيدات ومواقعها في الجين المراد دراستة
بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها ، وقد يعطي هذا معلومات غزيرة عن وظيفية هذا الجين. و أيضاً يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها.
و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط DNA أي في الأساس مبنى من جزيئات من deoxyribose ؛ماذا تعني هذة الكلمة؟ ⤵️
سكر ديوكسي مشتق من ريبوز السكر ،ديوكسي يعني فاقد ذرة الأكسجين. هذا هو الفرق الرئيسي بين Deoxyriboseو Ribose
وترتكز هذا الطريقة على مفهوم ان شريط الدنا في الاساس تكون من جزيئات من الديوكسي نيوكليوتيد dNTP . ويختلف الديوكسي نيوكليوتيد عن دي ديوكسي نيوكليوتيدddNTP بعدم وجود مجموعة الهيدروكسيل في النقطة الثالثة من حلقة السكر الخماسية الشكل .
في عملية تكوين خيط دنا مكمل للقالب الأساسي، يوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الرايبوزي مجموعة هيدروكسيل (OH) وهذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسةمن الجزيء الذي يليها وهكذا يتم الترابط لتكون شريط طويل من الدنا. بمعنى وجود مجموعة OH ضروري لإضافة deoxy nucleotidesجديد
من هذا المنطلق: قام سانجر بالاستفادة من هذه الخاصية (ضرورة وجود OH لصنع خيط مكمل للحمض النووي الاصلي) فبدل الجزيء من OH (dNTPs) الى H عن طريق اضافة دي ديوكسي نيوكليوتيد (ddNTPs)،الغرض من ddNTP هو توقف ترابط الجزيئات و ايقاف نمو شريط DNA عند هذا الحد لأن الترابط لا يتم في غياب OH
الخطوات الاساسية للقيام بهذا الاختبار بالترتيب :
القيام بنسخ الدنا وذلك على الشكل التالي :
1 .اضافة قطعة الدنا القالب template DNA والواجب ان تكون مفردة الخيط strand single
2 .اضافة بادئ Primer ذي نهاية حرة من نوع OH-3 مصنع كيماوياً
(كما يتم في تفاعل البلمرة المتسلسل PCR)
القيام بنسخ الدنا وذلك على الشكل التالي :
1 .اضافة قطعة الدنا القالب template DNA والواجب ان تكون مفردة الخيط strand single
2 .اضافة بادئ Primer ذي نهاية حرة من نوع OH-3 مصنع كيماوياً
(كما يتم في تفاعل البلمرة المتسلسل PCR)
3. اضافة النيوكليوتيدات من نوع ديوكسي نيوكليوتيد الأربعة dNTPs معلمة اشعاعياً.
4.أضافة انزيم بلمرة DNA
4.أضافة انزيم بلمرة DNA
5. بعد ذالك يقسم خليط التفاعل الى اربعة انابيب متساوية الكميات والتراكيز.
6. اضافة النيوكليوتيدات ddNTP كل نوع الى انبوبة معينة
وليكنddATP الى انبوبة1 و ddTTP الى انبوبة 2 و ddCTP الى انبوبة 3 و ddGTP الى انبوبة 4.
6. اضافة النيوكليوتيدات ddNTP كل نوع الى انبوبة معينة
وليكنddATP الى انبوبة1 و ddTTP الى انبوبة 2 و ddCTP الى انبوبة 3 و ddGTP الى انبوبة 4.
لتذكير: أن البادئ primar سيحتوي على مجموعة (OH) عند ذرة الكربون رقم 3 لجزئى
السكر مما يساعد على أرتباط أحد جزيئات النيوكليوتيدات المزود بها التفاعل– وبذلك سيبدأ
تخليق شريط جديد أمام كل شريط قديم وسيتوالى ترتيب النيوكليوتيدات الجديدة لـ بناء أشرطة
جديدة
السكر مما يساعد على أرتباط أحد جزيئات النيوكليوتيدات المزود بها التفاعل– وبذلك سيبدأ
تخليق شريط جديد أمام كل شريط قديم وسيتوالى ترتيب النيوكليوتيدات الجديدة لـ بناء أشرطة
جديدة
القطع الجديدة ستكون مشعة (لأنه تم تعليمها اشعاعياً)
و متفاوتة فى أطواليها(حسب نقطة الارتباط ب داي دي اوكسي نيوكليوتيد وتكون منتهية فيه في الطرف الآخر ( تم التوقف لأن لا يوجد OH في داي دي اوكسي نيوكليوتيد).وبعد انتهاء التفاعل في انابيب4 سنحصل على خليط جديد من DNA مختلف الاطوال
و متفاوتة فى أطواليها(حسب نقطة الارتباط ب داي دي اوكسي نيوكليوتيد وتكون منتهية فيه في الطرف الآخر ( تم التوقف لأن لا يوجد OH في داي دي اوكسي نيوكليوتيد).وبعد انتهاء التفاعل في انابيب4 سنحصل على خليط جديد من DNA مختلف الاطوال
تأخذ قطعع الـ DNA الناتجة عن عمليات المضافة الأربع و يجرى لها فصل كهربائي (gel electrophoresis) بإستخدام ألواح جيلاتين لمعرفة طول كل قطعة، و عن طريق تتبع ترتيب النيوكليوتيدات المكونة لقطعة كل شريط يمكن معرفة تسلسل جزئ DNA لهذة الجزء.
اعتذر عن الإطالة، لكن الطريقة طويلة و حاولت الاختصار قدر المستطاع.. يمكن الرجوع للمرجع بالأسفل للحصول على معلومات أكثر
docdro.id
docdro.id
جاري تحميل الاقتراحات...